| |||
|
Týdeník věnovaný aktualitám a novinkám z fyziky a astronomie. | |||
|
Expanzná mikroskopia
Vladimír Scholtz
Optický mikroskop je obľúbený, jednoduchý a lacný optický prístroj pre pozorovanie malých objektov. Zväčšenie mikroskopu ale nemôže byť nekonečné a pokiaľ sa veľkosť pozorovaného objektu, resp. jeho detailov, blíži vlnovej dĺžke použitého svetla, ohybové javy znemožnia ich jemnejšie rozlíšenie. Maximálne teoretické zväčšenie optického mikroskopu je pre viditeľné svetlo asi 2 000násobné. Pre väčšie zväčšenie je potrebné použiť buď žiarenie s kratšou vlnovou dĺžkou (napríklad elektrónový mikroskop) alebo naopak zväčšiť pozorovaný objekt. Túto druhú možnosť, nazvanú expanzná mikroskopia, popisuje nový článok [1].
Obrázok 1. Neuróny myšieho mozgu zobrazené expanznou mikroskopiou [1].
|
Optický mikroskop – zařízení ke sledování drobných předmětů v optickém oboru za pomoci soustavy čoček. Vynalezen byl v roce 1590 H. Janssenem a jeho synem Z. Janssenem v Holandsku. Elektronový mikroskop – mikroskop, který k zobrazení předmětů využívá vlnových vlastností svazku elektronů. Elektron se chová podobně jako světlo, jeho vlnová délka je ale výrazně kratší a tak je možné sledovat menší předměty než za pomoci světla. Elektronový mikroskop byl vynalezen v roce 1931 Ernstem Ruskou. |
Pred dvoma rokmi bola publikovaná práca [2], ktorá popisuje zabudovanie buniek myšieho mozgu, neurónov, do akrylátového gélu, ktorý bunky zafixuje. Pokiaľ sa gél nechá nabobtnať vo vode, zväčší svoj objem a s ním sa rozostúpia aj neuróny, na ktorých je potom možné jednoduchšie sledovať ich priestorové rozloženie. V tohtoročnej práci [1] sa podarilo zväčšiť aj samotné bunky, presnejšie ich „tieň“ alebo odtlačok v polymérnej matrici.
Ako gélový substrát bol použitý polymér zložený z akrylamidových reťazcov, ktoré boli navzájom zosieťované N-N'-metylénbisakrylamidom. Dehydrovaná a nabobtnaná štruktúra tohoto substrátu je znázornená na obrázku 2. Pokiaľ sa na takýto dehydrovaný substrát nanesie vypreparovaný rez napríklad z myšieho mozgu, jednotlivé bunky sa po nabobtnaní substrátu od seba navzájom vzďaľujú ako galaxie s expanziou Vesmíru (obrázok 3).
Obrázok 2. Dehydrovaná a nabobtnaná štruktúra gélového substrátu. Upravené z [1].
Obrázok 3. Preparát myšieho mozgu pred a po nabobtnaní substrátu. Upravené z [1].
V prípade, že prinútime bunky zanechať v substráte nejaký svoj jemnejší odtlačok, bude sa aj tento odtlačok pri bobtnaní subsrátu zväčšovať. Ako vhodná bunková štruktúra poslúžia mikrotubuly, ktoré tvoria akúsi mechanickú kostru každej bunky. Na mikrotubuly sa nechájú naviazať vhodné protilátky, na ktoré sa na ich druhej strane naviaže vhodný marker, ktorý sa zároveň pevne naviaže aj na sieť substrátu. Vhodnou proteolýzou sa teraz už nepotrebné bunky odstránia a relativne malá molekula markeru už pri bobtnaní substrátu nebráni rovnomernému zväčšovaniu. Nákres tohoto procesu je na obrázku 4. Zväčšenie objektu je asi 5násobné a rozlíšenie v klasickom fluorescenčnom mikroskope je približne 70 nm pôvodného nezväčšeného objektu.
Obrázok 4. Naviazanie markeru na mikrotubulus bunky. Upravené z [1]. Chemická štruktúra markeru, ktorý sa naväzuje na vhodné protilátky aj na gélovú matricu (vľavo hore), bunka so svojou štruktúrou mikrotubulov na pozadí matrice gélového substrátu (vľavo dole) a previazanie mikrotubulu s gélovou matricou. Na mikrotubulus sú naviazané pridané protilátky, na ktoré sa na druhom konci naviaže oligonukleotid markeru. Marker sa následne naviaže svojou metakrylovou skupinou na gélový polymér (vpravo).
Obrázok 5. Fotografia mikrotubulov z ľudskej ľadvinovej embrionálnej bunky HEK293 klasickou fluorescenčnou mikroskopiou (a) a po použití expanznej mikroskopie (b). Upravené z [1].
Obrázok 6. Fotografia rezu z tkaniva myšieho mozgu klasickou fluorescenčnou mikroskopiou (a) a po použití expanznej mikroskopie (b). Upravené z [1].
V prvej časti je nabobtnanie gélového substrátu po pridaní vody. V druhej časti je zobrazené ukotvenie markerov na substrát a zväčšenie obrazu po nabobtnaní. Mc Govern Institute for Brain Research at MIT. (mp4/h264, 10 MB)
Odkazy
